la cordonnerie
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Mesure de l’intensité respiratoire chez des levures.
TSpé ; semaine 8

Tp avec l’EXAO (Reacell de Jeulin)

Article mis en ligne le 13 novembre 2007
dernière modification le 23 novembre 2007

par Jean-Louis
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ATTENTION, le matériel que vous utilisez est fragile. À l’air libre la membrane de la sonde sèche et se détériore ; placez-la dans le récipient contenant l’eau distillée quand vous ne l’utilisez pas. Rincez l’extrémité de la sonde avec de l’eau distillée entre deux mesure. Ne pas toucher l’extrémité de la sonde, ni la dévisser.

Le matériel

- L’ensemble BIOREACTEUR est destiné à l’étude de phénomènes biologiques, ici la respiration.
- La suspension de cellules de Levure sera placée dans une enceinte transparente de volume fixe (10 ml). Cette enceinte est incluse dans une enceinte plus grande qui joue le rôle d’enceinte thermostatique.
- Le système d’agitation, à vitesse réglable par potentiomètre, permet d’homogénéiser le milieu.
- Un canal fin sert à l’injection des réactifs (remplir la seringue à injection en évitant les bulles d’air dans le corps de la seringue ou dans le cathéter).
- La sonde oxymètrique (électrode de Clarck) dose le dioxygène en continu. Cette sonde délivre une tension électrique proportionnelle au taux de dioxygène du milieu. Un interface transforme ce message analogique en un signal numérique traité par ordinateur. L’évolution de la teneur en oxygène est visualisée, sur le moniteur, sous forme graphique.
- Cette sonde doit être réétalonnée

La manipulation : Étude de la Respiration Cellulaire (levures)

Paramétrage du logiciel.
- Lancer le logiciel Réacell
- Choisir Respiration (on peut aussi avec "concentration d’O2 la courbe est alors décroissante)
- Choisir REGLAGES et étalonner l’oxymètre : suivre les instructions qui apparaissent sur l’écran du moniteur pour le réglage du zéro et de la pente. Le bouton pente est à gauche, le bouton réglage du zéro à droite) Prendre un temps de 6 minutes. Avec l’option CONCENTRATION EN OXYGENE min =0 ; max =20 (à modifier si besoin)

Décocher les options température et IL

Protocole Expérimental

On a dilué 20 g de levure de bière fraîche dans 1 litre d’eau et la suspension est aérée pendant 2 jours avant la manipulation, de façon à obliger les levures à consommer la totalité de leurs réserves énergétiques (glycogène) avant la manipulation.

Mettre la sonde en place.

Pour chaque trace, prélever 2.5 ml de suspension cellulaire, les verser dans l’enceinte, compléter par 2.5 ml d’eau (volume final 5 ml), relancer l’agitation qui devra être identique à chaque expérimentation (il devra en être de même pour la température).

À l’issue de chaque trace, vider et rincer soigneusement.

Mettre le bouchon et lancer l’agitateur.

Mesures à effectuer
On compare l’effet de quatre sucres.

- trace 1 : Levures (attendre la stabilisation de la trace) + 0,2 ml de glucose à 20g/l.
- trace 2 : Levures (attendre la stabilisation de la trace) + 0,2 ml de saccharose à 20g/l.
- trace 3 : Levures (attendre la stabilisation de la trace) + 0,2 ml de lactose à 20g/l.
trace 4 : Levures (attendre la stabilisation de la trace) + 0,2 ml de fructose à 20g/l.

(d’autres protocoles indiquent à 0,5 M. Quelle différence cela fait-il ?)
Il faut faire des témoins (répartissez vous le travail) : Que se passe-t-il si on injecte 0.5 ou 1 ml de sucre ? Ou de l’eau sans sucre ? Que se passe-t-il si on remlace les levures par de l’eau ? etc.

Enregistrement des mesures :

- Ne lancer l’enregistrement qu’après la stabilisation, quand la perturbation provoqué par l’agitation aura cessée. Au bout de 2 minutes injecter 0.2 ml de sucre par le fin canal du bouchon. (il faut bien enfoncer le fin flexible)
- Pour une nouvelle trace, choisir l’option S(uperposition) si l’on veut comparer les tracés. Sinon, fire un tracé neuf.
- À la fin de chaque mesure, sauvegarder les résultats sous le même nom sur disque : option D(onnées) / E(criture).
- Impression du graphique : option Sortie / Imprimante.

Interpétation

L’intensité respiratoire devra être mesurée pour chaque rupture de pente de chaque trace. L’influence des réactifs utilisés sur la respiration cellulaire pourra être déduite par une étude comparative des I.R. calculées.

Exemple de courbes obtenues :

- l’injection du glucose provoque l’augmentation de l’intensité respiratoire.

- une seconde injection augmente encore l’IR : le glucose était bien le facteur limitant.

- essai avec de l’eau pure à la place des levure : l’eau ne respire pas ! Cela peut sembler évident mais cela permet de s’assurer que l’on n’a pas affaire à un artefact.

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